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酰胺键的构建广泛存在于药物活性分子、天然产物和生物大分子的合成中。因此，高效可靠的多肽缩合试剂在有机合成中至关重要。到现在为止，已开发出多种类型的多肽缩合试剂，并不断拓展其应用范围，以应对复杂多样的分子结构需求。其中，TCFH-NMI组合便是一种“老树新枝”的代表，该组合最初是用于含有手性中心的羧酸和非活性胺的酰胺化反应，顺利获得在反应中原位生成高反应性的N-酰基咪唑鎓盐驱动反应的进行（见下图1），不仅具有优异的立体选择性，也实现了公斤级规模的生产（详见高效酸胺缩合的黄金组合：TCFH-NMI）。
图1
武田公司的一项研究显示，在含水溶剂中使用TCFH-NMI组合能以高收率得到酰胺产物，揭示了该组合在含水溶剂中的应用潜力。基于此，百时美施贵宝公司进行了更深层次的研究：以水为主要反应介质的条件下，探索TCFH-NMI酰胺化的适用范围和适用条件。
该公司针对TCFH-NMI组合在含水介质中的应用，探索并确立了通用操作步骤：将酸（500 mg， 1.0 eq）置于20 mL反应瓶中，依次加入含水溶剂（水：85%，有机溶剂：四氢呋喃/乙腈/丙酮，15%）、胺（1.1-1.3 eq）和NMI（3.5 eq），最后分三批加入TCFH（3*0.5 eq），批次间隔为10分钟，加完后反应30 min。
1. 溶剂影响
含水量影响：反应通常在85%的含水量下进行，对部分化合物而言，在含水量≤50%时，随含水量的增加，反应转化率降低；而当含水量超过85%时，反应转化率跟纯乙腈作溶剂时相当。
有机溶剂的选择：丙酮，四氢呋喃和乙腈可相互替代，其中丙酮作为共溶剂效果更优，其他水溶性有机试剂也可尝试，占比为15%。
2. 碱的用量
NMI当量（2.1和3.5 eq）对转化率和差向异构化均无显著影响。
Richard J. Fox和Dung L. Golden等人用武田制药公布的方法尝试合成一个肿瘤药物中间体（见下图2），但转化率低于40%，即使更改有机溶剂和添加表面活性剂也无显著改善，推测归因于异丙胺的空间位阻效应，改用位阻较小的胺（如苯胺衍生物）后，转化率显著提高。
图2
因而，该团队进一步对多种胺类化合物和羧酸进行了系统实验，总结了以下规律：
1. 胺类化合物
在水溶液中采用TCFH-NMI进行缩合反应，底物位阻越大，反应转化率越低。顺利获得对20种胺类化合物与4种羧酸进行酰胺化的试验（见下图3），得出以下规律：
芳香胺：含有弱吸电子基和给电子基转化率都很高；含强吸电子基则转化率较低；
脂肪胺：适用于强亲核性胺。
图3
另外，当使用氨作为反应底物时，含水条件下（85%水）反应效果较差，可能与氨在水中会形成氢键，导致其亲核性降低有关，当乙腈和水占比相当时，转化率明显提升。
2. 羧酸
除了空间位阻同胺类化合物一样，会对反应产生负面影响外，羧酸的pKa和取代基的电子效应亦是影响反应结果的关键因素。
pKa
在pKa 3.0-5.0的范围内，基本遵循pKa值越大，反应效果越好，其中在3.8-5.0范围内，转化率可达90%以上（见图4）。
图4
电子效应
顺利获得对23种不同的羧酸与苄胺反应进行Hammett式研究，结果显示：
取代基为中等电子取代基（包括吸电子和给电子）和中性取代基时，转化率最高（＞80%）；为强吸电子取代基时，转化率稍低（60-80%）；为强给电子取代基时，反应转化率很差（＜40%）。
优秀的缩合试剂或反应体系，需同时兼顾高反应效率和优异的立体选择性，该团队以苄胺与不同的氨基酸和肽进行差向异构化实验，其中N-Boc-苯丙氨酸和N-Boc-苯甘氨酸均取得了优异的转化率以及er（对映体比率）值＞99.9:0.1。然而，二肽与不同的胺进行测试时，er值却很差，猜测是因为二肽在反应过程中形成了易被消旋的噁唑酮中间体。
1. 克级规模
该团队不仅对筛选反应底物进行了大量实验，还进行了克级规模的放大，在丙酮/水=15%/85%体系中，进行五组不同的羧酸和胺类化合物的反应，所得产物纯度高，且过程质量强度（PMI）远低于行业平均值，生产效率高，展现出很好的生产潜力。
2. 活性分子合成
为进一步验证该试剂在含水体系中的应用价值，此团队将该体系应用于Linrodostat，奥拉帕尼，利伐沙班类似物，尼洛替尼，伊马替尼等活性分子的合成， 除了尼洛替尼因反应底物溶解度差，体系粘稠等原因导致效果差外，其余均已优异的收率和纯度得到目标化合物。
文章开头提到了TCFH-NMI的作用机制是顺利获得形成活性N-酰基咪唑鎓盐，促进反应的进行。而在含水体系中，此组合的反应效率取决于反应路径即生成N-酰基咪唑鎓盐和非反应水解路径的平衡（见下图5），当羧酸存在强吸电子基团或强给电子基团、胺类化合物含有很弱的给电子基团，以及两者位阻较大时均会降低反应路径的速率，从而使非反应路径的占比提高，降低产物的收率。
图5
该团队还开发了监督机器学习模型来预测TCFH-NMI组合在含水体系中进行酰胺化反应的转化率，包括羧酸和胺的立体和电子特性，顺利获得交叉验证和独立验证集评估模型的预测性能。结果表明，该模型在预测此组合酰胺化转化率方面表现良好。
总的来说，该团队研究了超过100例使用水作为主要反应溶剂的TCFH-NMI酰胺化案例，综合数据表明，这种组合在含水体系中是可行的，且在许多情况下可以高效、可直接分离得到产物，但该反应体系并非是一个适用于所有底物组合的解决方案。尽管如此，但该项工作为有助于水相缩合反应及其他有机反应在含水介质中的应用给予了借鉴和启发。
苏州Ebpay生物股份有限公司（股票代码：301393.SZ），创建于2003年，总部位于苏州市高新区，是一家为全球医药研发及生产企业给予特色原料的国家高新技术企业。产品主要应用于多肽、核苷酸和医药合成等领域，产品范围涵盖特色酰胺键构成用缩合剂、保护剂、链接剂、抗体偶联药物用蛋白质交联剂、分子砌块、脂质体、磷试剂等种类。现在已累计研发生产各类产品达1500多种。
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参考文献：
[1] Fox, R. J.; Golden, D. L.; Chartrand, C. C., et al. Tetramethylchloroformamidinium Hexafluorophosphate−N‑Methylimidazole Amidation in Water: Successes, Limitations, and a Regression Model for Prediction [J]. Org. Process Res. Dev., 2025.
